鸡（Chicken）甘油磷酸胆碱（GPC）ELISA检测豪运国际本豪运国际只能用于科学研究，不得用于医学诊断检测原理豪运国际采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被甘油磷酸胆碱（GPC）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成＊终的黄色。颜色的深浅和样品中的甘油磷酸胆碱（GPC）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品1. 酶标仪（450nm）2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3. 37℃恒温箱操作注意事项1. 豪运国际保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，＊终结果乘以5才是样本实际浓度。4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。5. 所有液体组分使用前充分摇匀。豪运国际组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、2、4、8、16、32 ng/ml试剂的准备 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。洗板方法1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。操作步骤1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3. 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。结果判断 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。 豪运国际性能1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。2. 灵敏度：＊低检测浓度小于1.0 ng/ml。3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。6. 有效期：6个月免责声明1. 豪运国际仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。
斑马鱼（Zebrafish）活性氧簇（ROS）ELISA检测豪运国际本豪运国际只能用于科学研究，不得用于医学诊断检测原理豪运国际采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被活性氧簇（ROS）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成＊终的黄色。颜色的深浅和样品中的活性氧簇（ROS）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品1. 酶标仪（450nm）2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3. 37℃恒温箱操作注意事项1. 豪运国际保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，＊终结果乘以5才是样本实际浓度。4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。5. 所有液体组分使用前充分摇匀。豪运国际组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、7.5、15、30、60、120 ng/ml试剂的准备 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。洗板方法1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。操作步骤1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3. 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。结果判断 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。 豪运国际性能1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。2. 灵敏度：＊低检测浓度小于1.0 ng/ml。3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。6. 有效期：6个月免责声明1. 豪运国际仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。 FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. Zebrafish reactive oxygen species (ROS) ELISA Kit instruction Intended useThis ROS ELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from blue to yellow and the intensity of the color is measured at 450 nm using a spectrophotometer. In order to measure the concentration of ROS in the sample, this ROS ELISA Kit includes a set of calibration standards. The calibration standards are assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a standard curve of Optical Density versus ROS concentration. The concentration of ROS in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.Sample collection and storagesSerum - Use a serum separator tube and allow samples to clot for 30 minutes before centrifugation for 10 minutes at approximately 3000×g. Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at -20℃ or -80℃.Avoid repeated freeze-thaw cyclesPlasma - Collect plasma using EDTA or heparin as an anticoagulant. Centrifuge samples for 30 minutes at 3000×g at 2-8℃ within 30 minutes of collection. Store samples at -20℃or -80℃. Avoid repeated freeze-thaw cycles.Cell culture supernates and other biological fluids - Remove particulates by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at -20℃or -80℃. Avoid repeated freeze-thaw cycles.Note: The samples shoule be centrifugated dequately and no hemolysis or granule was allowed.Materials required but not supplied1. Standard microplate reader(450nm)2. Precision pipettes and Disposable pipette tips.3. 37 ℃ incubatorPrecautions1. Do not substitute reagents from one kit to another. Standard, conjugate and microplates are matched for optimal performance. Use only the reagents supplied by manufacturer.2. Do not remove microplate from the storage bag until needed. Unused strips should be stored at 2-8°C in their pouch with the desiccant provided.3. Mix all reagents before using.Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature ( 20-25°C)Materials suppliedName96 determinations48 determinationsMicroelisa stripplate12*8strips12*4stripsStandard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubesSample Diluent6.0ml3.0mlHRP-Conjugate reagent10.0ml5.0ml20X Wash solution25ml15mlChromogen Solution A6.0ml3.0mlChromogen Solution B6.0ml3.0mlStop Solution6.0ml3.0mlClosure plate membrane22User manual11Sealed bags11Note: Standard (S0 → S5) concentration was followed by:0,7.5,15,30,60,120 ng/mlReagent preparation20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water 1:20.Assay procedure1. Prepare all reagents before starting assay procedure. It is recommended that all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.2. Add standard: Set Standard wells, testing sample wells. Add standard 50μl to standard well.3. Add Sample: Add testing sample 10μl then add Sample Diluent 40μl to testing sample well; Blank well doesn’t add anyting.4. Add 100μl of HRP-conjugate reagent to each well, cover with an adhesive strip and incubate for 60 minutes at 37°C. 5. Aspirate each well and wash, repeating the process four times for a total of five washes. Wash by filling each well with Wash Solution (400μl) using a squirt bottle, manifold dispenser or autowasher. Complete removal of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash, remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.6. Add chromogen solution A 50μl and chromogen solution B 50μl to each well. Gently mix and incubate for 15 minutes at 37°C. Protect from light.7. Add 50μl Stop Solution to each well. The color in the wells should change from blue to yellow. If the color in the wells is green or the color change does not appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.8. Read the Optical Density (O.D.) at 450 nm using a microtiter plate reader within 15 minutes.Calculation of results1. This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample. The standard curve is generated by plotting the average O.D. (450 nm) obtained for each of the six standard concentrations on the vertical (Y) axis versus the corresponding concentration on the horizontal (X) axis. 2. First, calculate the mean O.D. value for each standard and sample. All O.D. values, are subtracted by the mean value of the zero standard before result interpretation. Construct the standard curve using graph paper or statistical software. 3. To determine the amount in each sample, first locate the O.D. value on the Y-axis and extend a horizontal line to the standard curve. At the point of intersection, draw a vertical line to the X-axis and read the corresponding concentration. 4. Any variation in operator, pipetting and washing technique, incubation time or temperature, and kit age can cause variation in result. Each user should obtain their own standard curve.5. The sensitivity by this assay is 1.0 ng/ml6. Standard curve Storage： 2-8℃.validity： six months. FOR RESEARCH USE ONLY; NOT FOR THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC APPLICATIONS! PLEASE READ THROUGH ENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!
脂蛋白酯酶（Lipoprotein lipase，LPL）豪运国际说明书微量法100T/48S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义脂蛋白酯酶是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶，可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存，并在不同的组织表现出不同的生理意义。测定原理脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕榈酸酯产生4-硝基苯酚，在400nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、冷冻离心机、研钵、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制 试剂一：液体105mL×1瓶，4℃保存。试剂二：液体4mL×1瓶，4℃避光保存。试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。样品处理1. 组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。2. 细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。3. 血清：直接测定。测定操作对照管测定管样品（μL）2020试剂一（μL）80试剂二（μL）80混匀，45℃水浴10min试剂三（μL）100100充分混匀，25℃静置2min，于微量石英比色皿/96孔板，测定400nm处吸光值，记为A对照管和A测定管，△A=A测定管- A对照管计算公式a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y= 0.0581x -0.0169，R2=0.99821．按照蛋白浓度计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.0581×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 17.21×（△A+0.0169）÷Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/g 鲜重）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T= 17.21×（△A+0.0169）÷W3．按照细胞数量计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每104个细胞每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/104 cell）= （△A+0.0169）÷0.0581×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T = 17.21×（△A+0.0169）÷细胞数量4．按照液体体积计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫升血清每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反总÷V样÷T = 17.21×（△A+0.0169）V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10minb．用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y= 0.029x -0.0169，R2=0.99821．按照蛋白浓度计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.029×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 34.42×（△A+0.0169）÷Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/g 鲜重）=（△A+0.0169）÷0.029×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T= 34.42×（△A+0.0169）÷W3．按照细胞数量计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每104个细胞每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/104 cell）= （△A+0.0169）÷0.029×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T =34.42×（△A+0.0169）÷细胞数量4．按照液体体积计算酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫升血清每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.029×V反总÷V样÷T = 34.42×（△A+0.0169）V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min注意事项1. 试剂三加入混匀后静置两分钟立即测定，否则影响吸光值。2. 吸光值过高或者测定结果不稳定，则将酶液进行适当的稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
游离脂肪酸（FFA）含量豪运国际（测植物组织） 微量法100T/48S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：FFA既是脂肪水解的产物，又是脂肪合成的底物。FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，也可反映食物贮藏中的品质变化。测定原理：在弱酸性条件下，FFA与铜盐反应生成铜皂，在715nm处有特征吸收峰，在一定范围内游离脂肪酸含量与显色程度呈线性关系。自备仪器和用品：研钵、台式离心机、震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制：试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。试剂三：液体20mL×1瓶，4℃保存。样品中FFA提取：组织用蒸馏水冲洗干净后，用吸水纸吸取表面水分，捣碎后按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，震荡提取3h，8000g，4℃离心10min，取上清液待测。测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到715 nm。2. 对照管：取上清液0.4mL，加0.2mL试剂二，充分震荡5min，室温静置5min，取上层200μL于微量石英比色皿/96孔板，调零。3. 测定管：取上清液0.4mL，加0.2mL试剂三，充分震荡5min，室温静置5min，取上层200μL于微量石英比色皿/96孔板，测定吸光值，记为A。FFA含量计算：a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0075 x+ 0.0055，R2=0.994（1）按样本蛋白浓度计算FFA（nmol/mg prot）= (A-0.0055)÷0.0075×V1÷(V1×Cpr)=133×(A-0.0055)÷Cpr（2）按样本质量计算FFA（nmol/g 鲜重）= (A-0.0055)÷0.0075×V1÷(V1÷V2×W)=133×(A-0.0055)÷WV1：加入样本体积，0.4mL；V2：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。b.使用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0038 x+ 0.0055，R2=0.994（1）按样本蛋白浓度计算FFA（nmol/mg prot）= (A-0.0055)÷0.0038×V1÷(V1×Cpr)=266×(A-0.0055)÷Cpr（2）按样本质量计算FFA（nmol/g 鲜重）= (A-0.0055)÷0.0038×V1÷(V1÷V2×W)=266×(A-0.0055)÷WV1：加入样本体积，0.4mL；V2：提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。注意事项：1. 蛋白含量不可直接用提取的上清液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理盐水选用本公司的BCA法蛋白含量测定豪运国际。2. ＊低检出限为2 nmol/mL。
游离脂肪酸（FFA）含量豪运国际（测血清、动物组织、微生物、细胞） 微量法100管/96样正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：游离脂肪酸，也称为非酯化脂肪酸，在与白蛋白结合的血浆中循环。动物血液中的游离脂肪酸 (FFA )含量是一项重要的生理生化指标。血清中游离脂肪酸的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，游离脂肪酸的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。 测定原理：用有机溶剂萃取FFA。含有FFA的有机液与三乙醇胺铜反应,在有机相中形成脂肪酸铜 (铜皂) FFA一Cu。Cu离子与显色液反应形成紫红色络合物。反应形成的颜色深浅与Cu离子浓度的关系符合朗伯一比尔定律，因此可利用此反应进行比色。自备的仪器和用品：酶标仪、离心机、可调式移液器、96孔板、蒸馏水。试剂的组成和配制：萃取液：液体 120 mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体 15 mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体 15 mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，室温保存；试剂四：液体 12 mL×1瓶，4℃保存；样本前处理：1.动物组织：按照动物组织质量（g）：萃取液mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL萃取液），进行冰浴匀浆。震荡提取15min，5000 rpm 4℃离心5min，取有机相待测。2.血清：吸取50 μL血清样本，加入1 mL萃取液，震荡提取15 min后，4℃，5000 rpm离心5 min，取有机相待测。3.微生物、细胞：按照细胞数量（104个）：萃取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL萃取液）加入萃取液，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声2秒，间隔3秒，总时间3min）；震荡提取15 min，然后5000 rpm 4℃离心5min，取有机相待测。注意：有机相待测液可能存在于上层，也可能存在于下层，注意观察，体积较多的那一层即为有机相待测液。测定步骤：1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至550 nm。2、 工作液的配制：临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（m）=1（mL）：1（mL）：0.66（g）的比例充分混匀。（注意：现用现配，用多少配多少，在空瓶中配制，豪运国际中带有4个空瓶，先将试剂一与试剂二混合，＊后再加入试剂三粉剂）3、测定管：吸取600μL样本，加入200μL工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取200μL上层有机相，加入100μL试剂四，摇匀，10 min后测定550 nm的吸光值，记为A测定。4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取200μL上层有机相，加入100μL试剂四，摇匀，10 min后测定550 nm的吸光值，记为A空白。空白管只需测一次。△A=A测定-A空白注意：1、有机溶剂易挥发，加入96孔板后应尽快检测。2、测定管中加入的样本即样本前处理中的有机相待测液。 FFA含量计算：标准曲线：y = 0.0161x - 0.0141 R2 = 0.9985 x：棕榈酸标准品浓度（nmol/mL） y：吸光值差值△A 1、血清FFA含量计算：FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000 =1.242×(△A+0.0141)2、动物组织、微生物、细胞中FFA含量计算：（1）按样本蛋白浓度计算FFA含量(μmol/g鲜重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W× V1÷V2）÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷W（2）按样本蛋白浓度计算FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr V1：加入样本体积，0.6mL；V2：萃取液体积，1mL；V3：加入血清（浆）体积，0.05 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：动物组织样品质量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。注意事项：1. 蛋白含量不可直接用萃取液提取的有机相待测液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理盐水选用本公司的BCA法蛋白含量测定豪运国际。2. ＊低检出限为20 nmol/mL。
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)豪运国际说明书 微量法 100管/48样正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 测定原理ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。 需自备的仪器和用品分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成提取液：100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：10mL×1瓶， 4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存。试剂七：10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。 样本的前处理1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。2、 酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入2.5mL试剂一，充分溶解混匀；在试剂三瓶中加入2mL蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。3、定磷试剂的配制：按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂 应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。注意：配试剂＊好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，即取 0.5mL试剂七加9.5蒸馏水，充分混匀。5、酶促反应试剂名称（μL）对照管测定管试剂一90试剂二50试剂三40样本101037℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min后，90℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心5min，取上清6、定磷标准管空白管对照管测定管0.5μmol/mL标准磷应用液20蒸馏水20上清液2020定磷试剂180180180180混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温30min，冷却至室温，在 660nm处，蒸馏水调零，记录各管吸光值A。标准管、空白管只要做一次即可，每个测定管需要设一个对照管。注意：若测定管吸光值大于2，将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定，使吸光值小于2，可提高检测灵敏度，计算公式中乘以相应稀释倍数。 ACC活性计算： 1、按组织蛋白浓度计算：定义：每小时每毫克组织蛋白产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。ACC (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(V样×Cpr)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr2、按样本鲜重计算： 定义：每小时每g组织产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。ACC (μmol/h /g鲜重)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管）×V总÷(W× V样÷V样总)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W3、 按细菌或细胞密度计算：定义：每小时每500万细菌或细胞产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。ACC (U/104 cell)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管）×V总÷(500× V样÷V样总)÷T=0.02×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.1mL；V样：加入样本体积，0.01mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。
肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT-1）豪运国际说明书 微量法 100管/96样正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶A将酰基转移至L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。 测定原理：基于肉碱和脂酰辅酶A在丙二酰辅酶A存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶A(COA-SH)，与Ellman试剂DN-TB反应后，产生黄色的TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析CPT-1的活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水试剂组成和配制：试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：液体1.5mL×1支，-20℃保存；试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。② 将匀浆液于600g，4℃离心5min。③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CPT-1（此步可选做）。⑤ 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CPT-1测定。测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。2、样本测定（1）在试剂五中加入1mL无水乙醇，混匀，再加入22mL试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；（2）在试剂六中加入1mL蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六，混匀，记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。 CPT-1活性计算：a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2）按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W× V样÷V样总）÷T=177.8×ΔA÷W（3）按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.3556×ΔAV反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。b. 使用96孔板测定的计算公式如下：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2）按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V样÷V样总）÷T=355.6×ΔA÷W（3）按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.711×ΔAV反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）豪运国际说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。测定原理磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。试剂组成和配制 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体102mL×瓶，4℃避光保存。试剂二：液体3mL×1瓶，4℃避光保存。试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1mL无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。标准品：液体1mL×1支，4℃避光保存。酶液提取1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。3. 血清：直接测定。 测定操作空白管标准管测定管试剂一（μL）20试剂二（μL）303030标准品（μL）20样品（μL）20试剂三（μL）101010充分混匀，30℃反应30min，沸水浴1min，打开盖子，自然冷却2min。试剂四（μL）14014014030℃反应30min，于微量石英比色皿/96孔板，空白管调零，测定500nm处吸光值，分别记为A标准管和A测定管。酶活计算公式a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下1．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。注意事项1. 显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。2. 吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）豪运国际说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义磷脂酶C（EC3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。测定原理磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚，在410nm处有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。试剂组成和配制 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体102mL×1瓶，4℃保存。试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。试剂三：液体8mL×1瓶，4℃保存。酶液提取1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。3. 血清：直接测定。 测定操作空白管测定管样品（μL）20试剂一（μL）20试剂二（μL）100100充分混匀，37℃反应30min试剂三（μL）8080充分混匀，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定410nm处吸光值，分别记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。酶活计算公式a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R2 = 0.99911．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样×Cpr) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ W3．按照细胞数量计算酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ 细胞数量4．按照液体体积计算酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷V样÷T = 17.45×（△A+0.0103）V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30minb. 用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y = 0.0095x - 0.0103，R2 = 0.99911．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样×Cpr) ÷T = 35.09×（△A+0.0103）÷ Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T = 35.09×（△A+0.0103）÷ W3．按照细胞数量计算酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T =35.09×（△A+0.0103）÷ 细胞数量4．按照液体体积计算酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷V样÷T = 35.09×（△A+0.0103）V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）豪运国际说明书微量法100T/48S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂酰基水解酶，广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中，参与脂肪消化，精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程，在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。测定原理磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱（HEPC）产生游离巯基，与DTNB反应生成黄色物质，在412nm处有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、超速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。试剂三：液体×5瓶，-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入1.8mL试剂二充分混匀；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。样品处理1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。3. 血清：直接测定。测定操作对照管测定管样品（μL）2020试剂二（μL）180试剂三（μL）180充分混匀，37℃反应10min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定412nm处吸光值，记为A对照管和A测定管，△A=A测定管- A对照管计算公式a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下1．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位
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