谷氨酸(glutamic acid，Glu)含量测定豪运国际说明书 分光光度法 50管/48样正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：Gu广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是组成蛋白质的20种氨基酸之一，而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成，是生物体内主要氨基来源之一。此外，Glu还是味精的主要有效成分，常用做食品添加剂以及香料生产。测定原理：利用专用提取液提取，然后用显色剂进行显色，显色后在570nm下进行测定。需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。试剂的组成和配制：试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶， 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀溶解，用不完的试剂仍 4℃保存。谷氨酸提取： 1、细菌或培养细胞样品：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议1000万细菌或细胞加入2mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。2、组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.2g组织，加入2mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。3、血清（浆）或细胞培养液样品：按照血清（浆）或细胞培养液体积（mL）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.2mL血清（浆）或者细胞培养液加入2mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。2、 在有盖EP管中加入下列试剂：试剂名称（μL）测定管对照管样本1000试剂一1000试剂二200200混匀，90℃水浴20min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却，于570nm波长处比色，△A=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。谷氨酸含量计算：1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0074x- 0.5255；x为谷氨酸含量（µg/mL），y为吸光值。2、按照血清（浆）或者细胞培养液体积计算谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)3、按照蛋白浓度计算谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr4、按照样本质量计算谷氨酸含量(µg/g鲜重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W5、按照细菌或细胞密度计算谷氨酸含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)V1：加入反应体系中样本体积，1mL；V2：加入提取液体积，2 mL；V3：加入血清（浆）或细胞培养液体积，0.2 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1000：细菌或细胞总数，1000万。注意：1、该豪运国际仅适用于发酵液或组织中谷氨酸含量测定，检测下限为100µg/mL。2、标准曲线线性范围为：100µg/mL -600µg/mL。3、ΔA线性范围为：0.01-2；若大于2则需要将上清液用试剂一稀释至适当倍数后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。
吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）豪运国际说明书 分光光度法 50管/24样正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义： 脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS， Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。测定原理：吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成P5C过程中分解ATP生成ADP和无机磷，通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定P5CS活性。需自备的仪器和用品：可见外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制：试剂一：液体60 mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体6 mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体6 mL×1瓶，4℃保存；试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入25 mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入25 mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；试剂六：液体25mL×1瓶，室温保存；试剂七：10mmol/L标准磷贮备液10mL×1瓶，4℃保存。0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七 20倍稀释，即取 0.1mL试剂七加1.9mL蒸馏水充分混匀。定磷剂的配制：按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。注意：配试剂＊好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。样品酶液的制备：1、组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。操作步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm。2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）对照管测定管试剂二（μL）100样本（μL）100混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min试剂三（μL）100100试剂二（μL）100样本（μL）100混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列试剂）空白管标准管对照管测定管0.5μmol/ml标准磷应用液（μL）100上清液（μL）100100蒸馏水（μL）100定磷试剂（μL）1000100010001000混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。注意：1、由于每一个样都必须做对照，本豪运国际50管保证测 24份P5CS活性。2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。3、空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。计算 1、血清（浆）P5CS活力的计算:单位定义：每小时每毫升血清（浆）中P5CS 消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。P5CS活力（μmol/h/mL）=C标准管×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V总÷V样÷T=9 ×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）2、组织中P5CS活力的计算：（1）按蛋白浓度计算：单位定义：每小时每毫克组织蛋白中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。P5CS活力(μmol/h /mg prot)=C标准管×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V总÷（Cpr×V样）÷T =9 ×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr（2）按样本鲜重计算：单位定义：每小时每克组织中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。P5CS活力(μmol/h /g 鲜重)=C标准管×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V总÷(W× V样÷V样总)÷T=9 ×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.3mL；V样：加入样本体积，0.1mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
半胱氨酰亚砜裂解酶（L-cysteine sulfoxide lyase, CSL）豪运国际说明书分光光度法50T/24S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义半胱氨酰亚砜裂解酶（CSL）广泛存在于百合科葱属(如大蒜和洋葱)，十字花科芸薹属(如卷心菜，菜花，西兰花)，以及豆科中的合金欢属中，并通常被称为蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶的作用下转化成香菇精，以及产生丙酮酸、乙醛、甲醛和NH3。CSL是内源性甲醛生成的关键酶之一，测定CSL活性对于研究食品安全具有重要意义。测定原理CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亚砜反应产生丙酮酸，与2,4-二硝基苯肼反应，在碱性条件下显棕红色，在510nm下有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、研钵、离心机、分光光度计、1mL玻璃比色皿、恒温水浴锅、蒸馏水。试剂组成和配制 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。试剂一：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加入2mL水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存，临用前加入10mL水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存；试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存。试剂四：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。试剂五：液体30mL×1瓶，4℃保存。样本处理按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，4℃浸提40min。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定操作对照管测定管样品（μL）100100试剂一（μL）50蒸馏水（μL）50试剂二（μL）5050充分混匀，37℃反应20min试剂三（μL）200200试剂四（μL）100100充分混匀，室温反应5min试剂五（μL）500500充分混匀，静置5min，于1mL玻璃比色皿测定510nm处吸光值，记为A对照和A测定，△A=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。 计算公式标准曲线：y = 1.4626x + 0.0027，R2 = 0.9993；x为标准品浓度：μmol/mL；y为吸光度△A1. 按蛋白含量计算C-S lyase活性（μmol/min/mg prot）=（△A -0.0027）÷ 1.4626×V样÷(V样×Cpr )÷T =0.034×（△A-0.0027）÷ Cpr2. 按照样本质量计算C-S lyase活性（μmol/min/g 鲜重）=（△A -0.0027）÷ 1.4626×V样÷(V样÷V样总×W )÷T =0.034×（△A-0.0027）÷ WV样，加入样本上清体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T，反应时间，20min。 注意事项1. 若测定结果中吸光值超过2，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。香菇类样本活性较大，可能需要稀释80-100倍。
半胱氨酸（cysteine, Cys）含量测定豪运国际说明书 分光光度法 50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：蛋白质含有三种含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys是唯一一种含有巯基的含硫氨基酸，从甲硫氨酸转化而来，并且可与胱氨酸互相转化。Cys参与蛋白质二硫键的形成，经常是蛋白质活性中心的组成部分，还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外，Cys大量积聚在皮肤和粘膜表面，在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性，并且补充巯基，以维持皮肤的正常代谢，调节表皮＊下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。测定原理：Cys还原磷钨酸生成钨蓝，在600nm处有吸收峰；通过600nm吸光度，计算Cys含量。自备仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、85％磷酸和蒸馏水。试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。试剂二：液体×1瓶，4℃保存。试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。用前1天，向试剂三中加5 mL蒸馏水充分溶解，再加85％磷酸1.25mL，混匀后盖紧（防止水分散失）沸水浴2h；冷却后加20 mL蒸馏水，4℃可保存2周。标准品：粉剂×1瓶，临用前加10 mL蒸馏水，充分溶解。1μmol/mL标准液，4℃避光保存。用不完的试剂4℃可保存3天。半胱氨酸提取：1、 液体样品中半胱氨酸提取：取0.1mL液体样品，加试剂一0.9mL，充分混匀，8000g4℃离心10min，取上清液，待测。2、 组织中半胱氨酸提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10 min，取上清液待测。3、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。测定操作：1. 分光光度计预热30 min，调节波长到600 nm，蒸馏水调零。2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入100 μL蒸馏水，500μL试剂二，500μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A空白管。3. 标准管：取1mL玻璃比色皿，加入100 μL标准液，500μL试剂二，500μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A标准管。4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入100 μL上清液，500μL试剂二，500μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A测定管。注意：空白管和标准管只需要做一次。计算公式：1. 按液体样品的体积计算：半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 2. 按样本质量计算：半胱氨酸含量（μmol/g鲜重）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）÷W=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W3. 按照蛋白浓度计算：半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷（V样×Cpr）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr4. 按细胞数量计算：氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] ×（V样总÷V样×细胞数量）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量C标准品：标准品浓度，1μmol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.1 mL；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1mL。W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。注意事项：＊低检出限为100μmol/L。
氨基酸(amino acid, AA)含量测定豪运国际说明书 分光光度法 50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化＊能反应肝、肾的生理状态。另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。测定原理：氨基酸的α-氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通过测定570 nm吸光度，来计算氨基酸含量。自备仪器及用品：台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、无水乙醇、冰和蒸馏水。试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。试剂二：液体×1瓶，4℃保存。试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃避光保存。临用前加入2 mL无水乙醇，盖紧后充分混匀，再加入28mL蒸馏水混匀，避光保存。试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水，充分溶解。标准品：粉剂×1瓶，临用前加10 mL蒸馏水，充分溶解。1μmol/mL标准液，4℃避光保存。样品中AA提取：1. 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行室温匀浆，然后转移到1.5 mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自来水冷却后，8000g，4℃离心10min，上清液置冰上待测。2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。3. 血清等液体：直接检测。测定操作：1. 分光光度计预热30 min，调节波长到570 nm，蒸馏水调零。2. 空白管：取EP管，加入50μL蒸馏水，500μL试剂二，500μL试剂三和50μL试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A空白管。显色后务必在30min内测完。3. 标准管：取EP管，加入50μL标准品，500μL试剂二，500μL试剂三和50μL试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A标准管。显色后务必在30min内测完。4. 测定管：取EP管，加入50μL上清液，500μL试剂二，500μL试剂三和50μL试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A测定管。显色后务必在30min内测完。注意：空白管和标准管只需要测定一次。氨基酸含量计算公式：（1）按照样本质量计算氨基酸含量（μmol /g鲜重）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）÷W=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W（2）按照样本蛋白浓度计算氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷（V样×Cpr）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr（3）按照细胞数量计算氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] ×（V样总÷V样×细胞数量）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量（4）按照液体体积计算氨基酸含量（μmol /mL）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷V样=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) C标准品：标准品浓度，1 μ mol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.05 mL；W：样品质量，g；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.05 mL；V样总：样品提取液总体积，1mL，Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。注意事项：1. 豪运国际中试剂三、试剂四和标准品均需临用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天内使用完毕。2. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于2.5），用蒸馏水稀释后再测定。3. 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应在570nm处无吸收峰，因此，570nm处测定结果不含这两种氨基酸的量。4．＊低检出限为100μmol/L。
植物硝态氮豪运国际说明书分光光度法50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义硝态氮是植物＊主要的氮源。植物体内硝态氮含量反映了土壤中硝态氮的供应情况，可作为土壤氮肥的指标。测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养情况，而且对鉴定蔬菜和以植物为原料的加工制品的品质也有重要的意义。测定原理在浓酸条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（PH>12）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可比色测定计算得硝态氮含量。自备实验用品及仪器蒸馏水、天平、常温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。试剂组成和配制试剂一：粉剂×2瓶，4℃避光保存。临用前根据用量每瓶加2mL浓硫酸充分溶解。试剂二：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂三：粉剂×1支，4℃保存。样本处理按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL蒸馏水）加入蒸馏水，室温匀浆后置于90℃恒温水浴锅中浸提30min，期间不断晃动或者置于90℃恒温摇床中振荡提取30min，待冷却后于25℃，12000g离心15min，取上清待测。（深色植物匀浆后加入约3mg试剂三后再提取）测定操作表空白管测定管样本（μL）30蒸馏水（μL）30试剂一（μL）6060充分混匀，25℃静置30min试剂二（μL）14251425混匀，涡旋振荡，使出现的沉淀充分溶解，取1mL于1mL玻璃比色皿中测定410nm处吸光值A，△A=A测定管-A空白管注意：空白管只需测定一次。计算公式标准曲线：y=0.0156x+0.0073，R2=0.9997NO3—— N含量（mg/kg鲜重）=（△A-0.0073）÷ 0.0156÷（W÷V样总） =64.1×（△A-0.0073）÷WV样总：加入提取液体积，1mL，W：样本质量，g注意事项1. 试剂一配制好后尽快使用，4℃可保存一周。2. 试剂一和试剂二均具有强腐蚀性，操作时需做好防护措施。3. ＊低检出限为2μg/g。
植物全氮(粗蛋白)含量测定一．试剂配制1、标准溶液盐酸标准溶液[c (HCl)=0.1000 mol/L]，移取9 mL 浓盐酸（盐酸浓度36%～38%）用蒸馏水稀释并定容至1000 mL容量瓶，摇匀，用无水碳酸钠进行标定。无水碳酸钠标定方法：取50mL蒸馏水，加入10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，用配置好的盐酸溶液滴定至溶液由变为暗红色，消耗盐酸体积记为V0；再准确称取经300℃烘干1小时的无水碳酸钠0.2g，精确至0.0001，记为m，溶于少量蒸馏水中定容至50mL，加入10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，用配置好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸3分钟，冷却后继续滴定至溶液呈暗红色，消耗盐酸体积记为V。C（HCl）=m/[(V-V0)*0.05299],其中C（HCl）单位为mol/L。2、40%氢氧化钠溶液1000 ml（400 g/L）400g氢氧化钠溶解于1000mL无氨蒸馏水中；3、2%浓度硼酸溶液2000 ml （20g/L）分析纯硼酸40g溶于2000ml无氨蒸馏水中；4、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂A：称取0.1g 甲基红，用无水乙醇定容至100 ml；B：称取0.1g 溴甲酚绿，用无水乙醇定容至100 ml. 临用时按照A:B=1:5混匀。取10ml加入1000ml硼酸溶液中。5、高锰酸钾溶液：2.5g高锰酸钾溶于50mL蒸馏水中。6、1:1硫酸溶液：100mL浓硫酸缓慢加入100ml蒸馏水中，边加边搅拌。二．样品消解1. 将植物样本粉碎，80℃烘干至恒重，过40目筛，称取约0.3g，加入消化管中，同时取空消化管两支，用移液管分别往每管中加入10mL浓硫酸，轻轻晃动消化管。2. 将20支消化管全部置于石墨消解仪上，盖好盖子，打开废气回收系统以及石墨消解仪，温度设置为：曲线加热100℃，10min；280℃，10min；400℃，40min。3. 取出消化管冷却至室温，切勿在样品冷却之前开盖。每支消化管中缓慢加入1mL过氧化氢，摇匀，重新放置在石墨消解仪上，温度设置为：曲线加热200℃，10min；320℃，30min；400℃，30min。4. 取出消化管冷却至室温，切勿在样品冷却之前开盖。每支消化管中缓慢加入0.5mL过氧化氢，摇匀，重新放置在石墨消解仪上，温度设置为：曲线加热200℃，10min；320℃，30min；400℃，60min。若样本未呈现澄清状态，应继续加热至澄清，即消解完全。5. 关闭石墨消解仪，待样品冷却后关掉废气回收系统。三．全氮测定1. 将滴定酸桶，硼酸桶，碱桶，蒸馏水桶管路按照标示插好（滴定酸桶的管子应插到底部），将硼酸桶，碱桶，蒸馏水桶的液位检测插好。2. 打开定氮仪与循环水系统，进入清洗界面，先进行两次硼酸清洗管路，再进行一次换酸清洗，一次碱管路清洗。3. 装一只空的消化管，关好防护门。点击【测试】菜单系统自动进入操作模式界面，选择【自动测试】，常规，设置参数为：样品编号；样品重量：0.000g。滴定酸浓度：标定好的盐酸浓度(mol/L)；空白值：0.000mL；蛋白系数：样品固定的转换系数。硼酸：15ml；稀释水：20mL；碱液：0mL；蒸馏：5min；设置完成后，点击【确定】即可进入自动测试功能。4. 测试完成后打印测定结果。5. 打开安全门，戴棉质手套取出消化管，放入样品空白管，关好防护门。点击【测试】菜单系统自动进入操作模式界面，选择【自动测试】，常规，碱液参数设置为40mL，其余参数同步骤3，重复步骤3。6. 样品测定：设置参数为：样品编号；样品重量：称取的样品实际质量，g。滴定酸浓度：标定好的盐酸浓度(mol/L)；空白值：两支空白管滴定用酸量的平均值，mL；蛋白系数：样品固定的转换系数。硼酸：15ml；稀释水：20mL；碱液：40mL；蒸馏：5min；设置完成后，点击【确定】即可进入自动测试功能。7. 测试完成后打印测定结果。8. 进行仪器清洗，然后关闭循环水系统及定氮仪，然后清洁仪器。四．注意事项1. 禁止使用边缘有缺口，或者有裂缝的消化管进行消解，消解时盖子放置好，以免废气泄露，消解仪工作状态尽量不要靠近仪器，但是要经常观察管内变化，若出现异常情况，立即断电。2. 开始蒸馏时，消化管中液体的总体积以不超过总体积的1/3。3. 拿取消化管时，注意高温烫伤。放置消化管时，左右旋转几下，确保消化管与蒸馏头密封。4. 每日做完实验要用洗瓶冲洗蒸馏头残余碱液，仪器前部的槽皿中，如果积有液体，请擦洗干净。5. 为了延长防溅装置的使用寿命，请每天工作结束后清洗两次左右：即消化管加水150mL空蒸5分钟。（空蒸仪器把加碱量设置为“0”）。6. 关机前，需将接收杯内液体排净，仪器使用结束后要关闭水源、电源，仪器上要放置一空消化管（防止防溅装置内残留液体流到仪器上）。 7. 做完实验将消解管清洗干净（包括壁内和壁外），然后放烘箱烘干，烘干后若长时不用则收起来。消解仪各部位上若有硫酸残留需及时擦拭干净一面被腐蚀，消解仪盖子以及托盘需长清洗保持洁净。
植物铵态氮豪运国际说明书 分光光度法50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义氮素是构成生物体的一种必需元素，自然界中的氮素循环包括许多转化作用。空气中的氮气被固氮微生物及植物与微生物的共生体固定成氨态氮，经过硝化微生物的作用转化成硝态氮，后者被植物或微生物同化成有机氮化物，植物组织氨氮含量可反映植物受胁迫的程度。测定原理α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应， 缩合生成蓝紫色物质，在580nm处有特征吸收峰。自备实验用品及仪器天平、研钵、常温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。试剂组成和配制提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。试剂二：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加0.5mL蒸馏水充分溶解。试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存。样本处理按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，室温匀浆后于25℃，12000g离心10min，取上清待测。测定操作表空白管测定管样本（μL）200蒸馏水（μL）200试剂一（μL）300300试剂二（μL）1010充分混匀，沸水浴5min后自然冷却10min试剂三（μL）500500充分混匀，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定580nm处吸光值A，分别记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管注意：空白管只需测定一次。计算公式标准曲线：y=0.1535x-0.0279，R2=0.9993NH4+—N含量（μg/g 鲜重）=（△A+0.0279）÷ 0.1535×V反总÷（W×V样÷V样总） = 32.9×（△A+0.0279）÷WV反总：反应总体积，1.01mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL，W：样本质量，g注意事项1. 提取好的待测液尽快测定，低温保存不得超过24小时。2. 沸水浴时间不宜过长，否则会对测定结果有影响。3. 显色后20min内完成测定。4. ＊低检出限为18μg/g。
亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）豪运国际说明书 分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。测定原理亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少，即540nm处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。需自备的仪器和用品天平、研钵、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1mL玻璃比色皿。试剂的组成和配制提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加12mL蒸馏水溶解。试剂三：液体12mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）试剂四：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）试剂五：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。酶液提取1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。2．细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。测定操作表空白管对照管测定管样本（μL）100100蒸馏水（μL）100200试剂一（μL）200200试剂二（μL）200200200混匀后，25℃反应1h试剂三（μL）200200200充分震荡30S上清液（μL）350350350工作液（μL）700700700充分混匀，蒸馏水调零，静置3min后测定540nm处吸光值，分别记为A空白管、A对照管、A测定管。空白管只要做一管，每个测定管需设一个对照管。 计算公式标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。1．按照蛋白含量计算酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（V样×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷Cpr2. 按照样本质量计算酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（W ×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷W3. 按照细胞数量计算酶活单位定义：每104个细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷细胞数量V标：标准液体积，0.2mL；V样：体系中加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g注意事项1. 配制好的工作液3天内使用完。2. 若吸光值超过3，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。4. 标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。5. A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-3。
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定豪运国际说明书 分光光度法 50管/24样正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。测定原理NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有＊大吸收峰，可用分光光度法测定。需自备的仪器和用品可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。试剂二：液体8mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；试剂四：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。样品的前处理动植物组织样品的前处理：（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。注意：1、 建议使用新鲜没有冷冻过的样本。2、 一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（A测定管≤A对照管）则需要诱导处理。细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。测定步骤1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。2、样本测定（在EP管中加入下列试剂）试剂名称（μL）加样孔测定管对照管标准管空白管样本1001000.1μmol/mL标准液100蒸馏水375475试剂一375375试剂二125125125125 混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min试剂三250250250250试剂四250250250250混匀，25℃室温显色20min， 540nm下比色注意：1、 标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。2、诱导处理后的样本对照管中试剂二改成加125μL蒸馏水。 NR活性计算：（1）按样本鲜重计算：单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。NR（μmol/h/g 鲜重）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W（2）按样本蛋白浓度计算：单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。NR（μmol/h/mg prot）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷CprC标准管：标准管浓度，0.1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
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